采用三氯化铝比色法测定中药总黄酮含量的可行性研究

黄酮类化合物(Flavonoids)以其广泛的药理作用倍受青睐,而中药材中总黄酮的含量测定成为近年来研究黄酮化合物所关注的焦点。中药总黄酮的含量测定一般采用比色法、高效液相色谱法等。比色法是被5中国药典6所采用的最常见的总黄酮测定方法,其中又以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法常用,在碱性条件下,利用其与黄酮物质生成红色铝螯合物为特征,以芦丁为对照,在510nm处测定吸光度,从而得到待测物质总黄酮的含量,但是研究发现具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在芦丁显色的最大波长处(510nm左右)也有较强吸收,而黄酮类成分黄芩素、山柰酚在此波长处没有吸收,从而说明采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法,以芦丁作为对照,不能排除非黄酮类物质的干扰,这种方法测定中药总黄酮含量的专属性不强。因此,本实验采用另一种常用的比色法:三氯化铝比色法,对几类典型结构的黄酮类化合物(芦丁、儿茶素、木犀草素、鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、葛根素、金丝桃苷、橙皮苷)及多酚类化合物(2,3-二羟基苯甲酸,绿原酸,和厚朴酚,阿魏酸)三氯化铝显色前后的吸收峰(200~600nm)进行比较,分析以芦丁为对照品的三氯化铝比色法测定中药总黄酮的合理性,并对芦丁显色的pH值,三氯化铝浓度、显色温度等条件进行优化研究。

研究结果表明：

葛根素、蒙花苷、橙皮苷加入三氯化铝，反应前后紫外吸收峰的位置没有发生改变，而其余物质的紫外吸收峰均发生红移。从结构上分析，葛根素、蒙花苷、橙皮苷只存在5位羟基，不存在邻二酚羟基和3位羟基，由此可见三氯化铝的显色反应主要发生在3位羟基、4位羰基和邻二酚羟基，只存在5位羟基、4位羰基时黄酮类物质与三氯化铝不发生反应。

芦丁与三氯化铝发生显色反应，生成黄色络合物，在421nm左右有较强吸收。实验对几种常见的多酚类化合物紫外光谱图进行了扫描，结果表明对于含邻二酚羟基的非黄酮化合物：2，3一二羟基苯甲酸、阿魏酸、和厚朴酚、绿原酸，三氯化铝显色前后在421nm左右均没有吸收峰，消除了非黄酮类化合物对显色的干扰。

槲皮素为芦丁的苷元，显色后在437nm左右有较大吸收，而芦丁的最大吸收峰在421nm，说明黄酮的苷和苷元的极性相差较大，槲度素3位羟基可能对反应有影响。木犀草素的结构和芦丁相比，3位没有羟基，显色后在414nm有最大吸收，从而进一步说明3住羟基可能对三氯化铝显色反应有影响

具有典型结构的常见的黄酮类苷和苷元：金丝桃苷，芦丁，异鼠李素，山柰奈酚，三氯化铝显色前在421nm处无吸收，显色后均在芦丁的最大吸收峰421nm左右有较大的吸收。在现今的实验条件下，对于大多数黄酮类中药材而言，多含有黄酮苷，常见的苷在此波长处有较强吸收，而非黄酮类物质在此处无吸收。因此以芦丁作为对照，三氯化铝比色法可以成为测定中药总黄酮含量的理想方法。

对于任一络合反应，溶液的酸碱度会影响金属离子的水解及存在形式，影响络合物的组成。当采用盐酸（氢氧化钠）调节显色溶液pH值时，因其酸（碱）性较强，破坏络合物的结构，无法测得中药总黄酮含量的真实值，而采用NaAc-HAc缓冲盐溶液时，加入前后芦丁的吸收峰位置不变，仍在359nm处，所以采用NaAc-HAc缓冲盐调节显色溶液的pH值。

从方法的可行性考察结果可以看出，以金丝桃苷为样品，采用2种方法考察回收率，优化的方法准确度更高，所以加入O.1mol／L三氯化铝，pH为5.2的NaAc-HAc缓冲溶液，40℃水浴加热1Omin为三氯化铝比色法的优化显色条件。