三氯化铝比色法测定稻壳中总黄酮含量的方法研究

摘 要： 本研究以芦丁为对照品, 建立了三氯化铝比色法测定稻壳中总黄酮含量的分析方法。系统考察了显色剂浓度及用量、反应时间、反应温度等因素对总黄酮测定值的影响。结果表明, 三氯化铝比色法测定稻壳中总黄酮含量的最优条件为:1mL的稻壳提取液中加入1mL质量浓度为2.0%三氯化铝溶液, 30%乙醇定容至10mL, 不避光条件下于35℃水浴反应5min, 279nm处测定吸光度。该法稳定性好、回收率高, 适用于稻壳中总黄酮含量的测定。

随着农作物新型栽培技术的推广及农业现代化推进步伐的加快, 我国的水稻产量已达2亿t以上, 即每年可产生0.4亿t左右的稻壳[1], 面对如此数量庞大的稻壳生物质资源, 若能加以综合利用, 制备出系列高附加值产品, 形成完整的生物质循环产业链, 这对于变废为宝, 缓解环境压力, 实现农民财富增收具有重要意义。

稻壳已被发现富含黄酮类等天然活性成分, 而黄酮类化合物具有抑菌抗炎、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等多种药理及保健作用[2,3], 市场前景极为广阔。人们已采用各种方法对对稻壳中总黄酮进行了提取, 然而对其含量测定分析的研究报道较少。已有文献中对稻壳黄酮含量的分析, 多采用《中国药典》中的NaNO2-Al (NO3) 3-NaOH比色法, 该法被发现对一些植物黄酮含量分析时专属性不强[4,5]。本研究以芦丁为对照品, 采用三氯化铝比色法测定稻壳中总黄酮的含量, 并对各种显色条件进行了考察, 建立了一种稻壳中总黄酮含量测定的方法, 以期为稻壳黄酮的开发提供科学依据。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

稻壳 (市售) ;芦丁标准品 (上海伊卡生物技术有限公司) ;无水乙醇、三氯化铝、Na OH、HCl, 国产分析纯;实验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外-可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) ;XA-1微型高速粉碎机 (姜堰市银河仪器厂) ;KQ5200DE超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ;DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 (上海精宏实验设备有限公司) ;80-2台式离心机 (上海浦东物理光学仪器厂) 。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制

精确称取100℃干燥至恒重的芦丁标准品18mg于50m L的烧杯中, 加入适量无水乙醇溶液, 常温下超声处理5min, 待芦丁全部溶解后转移至100m L的容量瓶中, 用30%乙醇溶液定容, 配成0.18mg·m L的芦丁标准液。精密移取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L分别置6支25m L的比色管内, 加入10m L 0.1%三氯化铝溶液, 用30%乙醇定容至刻度, 摇匀, 于室温静置10min后测定吸光度, 并绘制标准曲线。以芦丁对照品浓度C (mg·m L) 为横坐标, 吸光度A为纵坐标, 得回归方程为A=38.921C+0.0084, R=0.9993。

1.3.2 稻壳中总黄酮的提取

稻壳洗去杂质后低温烘干, 粉碎过50目的筛。精确称取10g稻壳粉, 经石油醚浸泡24h, 过滤, 滤渣加入200m L质量分数为50%的乙醇溶液, 于室温下超声提取0.5h, 过滤。滤渣以同样方法再次超声提取并抽滤, 滤液合并后于55℃下减压浓缩并定容于100m L的容量瓶中, 低温贮藏备用。

1.3.3 稻壳黄酮的紫外-可见光谱扫描

三氯化铝比色法:移取1m L稻壳黄酮粗提液置10m L容量瓶中, 加入0.1%的三氯化铝-30%乙醇溶液4m L, 30%的乙醇定容至刻度, 静置10min后, 以试剂空白参比, 在200~550nm区间进行光谱扫描。

1.3.4 显色条件的优化

1.3.4. 1 三氯化铝加入量

精密移取0.5m L稻壳提取液到10m L容量瓶内, 加入不同体积 (1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m L) 0.1%三氯化铝溶液, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于30℃水浴中反应10min, 于279nm测定吸光度值。

1.3.4. 2 三氯化铝浓度

精密移取1m L稻壳提取液到10m L容量瓶内, 加入不同质量浓度0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%三氯化铝溶液, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于30℃水浴中反应10min, 于279nm测定吸光度值。

1.3.4. 3 反应温度

精密移取1m L稻壳提取液到10m L容量瓶内, 加入浓度为2.0%三氯化铝溶液1m L, 30%的乙醇定容至刻度, 再分别置于不同温度20、25、30、35、40、45℃水浴中反应10min, 于279nm测定吸光度值。

1.3.4. 4 反应时间

精密移取1m L稻壳提取液到10m L容量瓶内, 加入浓度为2.0%三氯化铝溶液1m L, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于35℃水浴中分别反应5、10、15、20、25、30min, 于279nm测定吸光度值。

1.3.5 稳定性试验

精密移取1m L稻壳提取液到10m L容量瓶内, 加入浓度为2.0%三氯化铝溶液1m L, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于35℃水浴中反应5min后取出, 每间隔10min测定吸光度值, 计算RSD值。

1.3.6 精密度试验

取6个10m L容量瓶, 分别依次加入1m L稻壳提取液、1m L 2.0%三氯化铝溶液, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于35℃水浴中反应5min, 测定吸光度并计算RSD值。

1.3.7 回收率试验

精密移取1m L稻壳提取液到10m L容量瓶内, 加入稀释芦丁标准溶液1m L, 浓度为2.0%三氯化铝溶液1m L, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于35℃水浴中分别反应5min, 测定吸光度并考察方法的回收率。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

图1 芦丁和稻壳黄酮紫外可见吸收光谱图

从图1可以看出, 芦丁标准品溶液在272.5nm、417nm处各有一个吸收峰, 稻壳黄酮提取液则在279nm处具有吸收峰。279nm处稻壳黄酮和芦丁的吸收峰近似吻合, 可以选择279nm处进行稻壳黄酮含量的测定。

2.2 显色条件的优化

2.2.1 三氯化铝用量的选择

图2 三氯化铝用量的选择

由图2可见, 随着Al Cl3使用量的增加, 吸光度值迅速增大, 在加入量为1m L时便达到最大值, 此后再增大Al Cl3加入量, 吸光度值呈下降趋势并逐渐趋于稳定, 从经济角度分析Al Cl3体积选择1m L即可。

图3 三氯化铝浓度的选择

由图3可见, 随着三氯化铝浓度的增加, 吸光度值快速增加, 在浓度为2.0%时达到最大值, 此后再增大三氯化铝浓度, 吸光度值随后缓慢下降, 因此, 适宜的三氯化铝浓度选择2.0%。

2.2.3 反应温度的选择

图4 三氯化铝反应温度的选择

由图4可见, 随着三氯化铝反应温度的升高, 吸光度值缓慢升高, 在温度为35℃时达到最大值, 因此, 适宜的三氯化铝反应温度选择35℃。

2.2.4 反应时间的选择

图5 三氯化铝反应时间的选择

由图5可见, 随着三氯化铝反应时间的增加, 在5~20min吸光度值稳定, 水浴时间再延长吸光度呈一定下降趋势, 因此, 适宜的三氯化铝反应时间选择5min。

2.3 稳定性试验

表1 稳定性试验结果

由表1可知, 此测定方法的相对标准偏差为0.687%, 因此稻壳黄酮溶液中加入三氯化铝显色后在60 min内显色较稳定, 因此测定时控制在60min内完成。

2.4 精密度试验

表2 精密度实验结果

由表2可见, 精密度实验的相对标准偏差0.400%, 因此, 该方法测定的精密度在误差范围内, 用该法测定稻壳中总黄酮, 精密度良好。

2.5 回收率试验

表3 回收率试验结果

由表3可知, 该方法测定稻壳中总黄酮含量, 加标回收率为100.05%, 相对标准偏差为0.770%, 因而该方法具有较高的回收率。

3 结论

实验采用三氯化铝比色法测定稻壳提取物总黄酮的含量, 并对测定条件进行了优化, 优化后的工艺条件为:反应温度35℃、反应时间5 min、显色剂加入量1m L、显色剂质量浓度2.0%, 此条件下可成功地用于稻壳提取物中总黄酮的定量分析, 该测定方法稳定性好、精密度及回收率较高。

参考文献

[1]孙庆文, 许珂敬, 郭彦青.高活性稻壳灰的制备、提纯及应用的研究进展[J].中国陶瓷, 2012, 48 (7) :1-5.

[2]关海宁, 乔秀丽, 刁小琴, 等.响应面法优化超声辅助提取稻壳中黄酮的工艺研究[J].食品工业, 2013, 34 (7) :67-70.

[3]万明, 宋永钢, 杨菠.黄酮类化合物的药理作用及其在食品工业中的应用[J].江西食品工业, 2007, (3) :47-49.

[4]何珺, 颜仁梁, 刘志刚.Na NO2-AL (NO3) 3-Na OH比色法测定总黄酮应用中的常见问题[J].今日药学, 2009, 19 (12) :18~21.

[5]郑有飞, 石春红.天然黄酮物质提取技术和分析方法的研究进展[J].分析科学学报, 2009, 25 (1) :102~107.

作者简介：宗春燕 (1976-) , 女, 讲师, 硕士研究生, 2006年毕业于中国矿业大学应用化学专业, 主要从事精细化学品的制备与工艺研究。