D-半乳糖联合三氯化铝对C57小鼠海马Bcl2表达的影响

摘 要： 目的 探讨D-半乳糖联合三氯化铝 (AlCl₃) 对C57小鼠海马B淋巴细胞瘤-2 (Bcl₂) 表达的影响及在阿尔茨海默病 (AD) 发病中的意义。方法 D-半乳糖90 mg·kg-1·d-1联合AlCl3 40 mg·kg-1·d-1连续90 d腹腔注射制造AD小鼠模型;通过比较全脑图片及糖水实验初步鉴定模型复制是否成功;免疫组化检测AD及野生型对照组小鼠海马CA1、CA3和DG区Bcl2蛋白表达水平。结果 与对照组比较, AD小鼠完整脑组织表面泛白、无血色, 血管明显减少。糖水偏好实验:与对照组比较, AD组小鼠糖水偏好百分比明显下降 (P<0.01) 。与对照组相比, AD小鼠海马CA1、CA3和DG区Bcl2蛋白阳性表达明显减少, 呈深棕色阳性颗粒数目明显减少 (CA1、CA3区P<0.05;DG区P<0.01) 。结论 D-半乳糖联合三氯化铝通过抑制Bcl2的表达, 导致海马神经细胞异常凋亡, 进而引起AD的发生、发展。 阿尔茨海默病 (AD) 又称老年性痴呆, 是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统病变, 是一种慢性进行性中枢神经系统变性疾病。基底前脑胆碱能神经元丢失、神经原纤维缠结 (NFT) 和老年斑 (SP) 等为AD的主要病理特征。细胞凋亡信号通路在中枢神经系统的生长发育、衰老退化进程中都起着关键作用。在发育过程中, 为对抗一因多效, 细胞凋亡会损伤一些衰老的细胞, 利用这种程序性的方式, 可以将这些衰老的神经细胞移除。在成年脑组织中, 神经元通过抗细胞凋亡保持神经突触的可塑性并维持生存。B淋巴细胞瘤-2 (Bcl₂) 属于抗细胞凋亡家族成员, 可以调节某些前细胞凋亡因子, 如Bax的表达。此外, 增加Bcl2的表达可以降低Bax表达, 抑制凋亡复合体的形成, 达到抗细胞凋亡的目的。本研究拟观察D-半乳糖联合三氯化铝对C57小鼠海马CA1区、CA3区和DG区Bcl2表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

清洁级雄性C57小鼠, 购于湖北省实验动物研究中心, 动物许可证号:SCXK (鄂) 2008-0005。

1.2 方法

1.2.1 建立AD小鼠模型

选用清洁级健康雄性C57小鼠, 体重15~20 g, 安静环境饲养, 自由取食饮水, 通风良好, 室温22℃~25℃, 适应性喂养1 w后随机分为两组, 每组15只。AD组采用Luo等的造模方法腹腔注射D-半乳糖 (武汉科瑞生物) 90 mg·kg·d (生理盐水配制) 和Al Cl3 (天津福晨化学试剂厂) 40 mg·kg·d (生理盐水配制) 溶液, 连续90 d;野生型对照组腹腔注射等量的生理盐水。

1.2.2 糖水偏好实验

用糖水和自来水双瓶给实验大鼠供饮, 通过测量剥夺饮水12h后大鼠1 h内的糖水和自来水消耗量, 计算糖水偏好百分比 (糖水偏好百分比=糖水消耗量/总液体消耗×100%) 。

1.2.3 免疫组织化学

1.2.3. 1 相关步骤

行为学实验结束后, 小鼠用10%苯巴比妥 (300 mg/kg) 腹腔注射麻醉, 打开胸腔, 暴露心脏。将注射针头插入左心室, 剪开右心耳, 快速灌注生理盐水, 待右心耳处流出澄清液体, 换4%多聚甲醛10ml/min灌注至大鼠四肢强直, 然后将小鼠断头, 快速取出脑组织, 置4%多聚甲醛中固定、过夜。常规石蜡包埋脑组织, 约5μl矢状切片。切片常规脱蜡, 将切片浸入柠檬酸盐缓冲液微波炉加热至沸腾, 3 min×5次。冷却后磷酸盐缓冲液 (PBS, p H 7.2~7.6) 洗涤3次。滴加3%H2O2室温孵育15 min (消除内源性过氧化物酶的活性) , PBS洗3 min×3次。正常山羊血清封闭, 室温孵育10 min。倾去血清, 不洗, 滴加一抗鼠抗Bcl2抗体 (1∶200, A0208, Abclonal公司, 美国) , 4℃过夜, PBS洗3 min×3次, 滴加生物素标记的二抗, 37℃孵育20 min, PBS洗3 min×3次。二氨基联苯胺 (DAB) (GK600710, 上海基因科技公司) 显色, 显微镜下控制显色。苏木精复染, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片后镜下观察蛋白表达, 拍照, 留存。

1.2.3. 2 结果判读及图像分析

显微镜下观察海马CA1区、CA3区和DG区胞质出现棕黄色的物质为Bcl2阳性染色。采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统, 对每例Bcl2免疫组化染色切片的阳性表达颗粒进行定量测量。每张切片放大10×40倍, 随机选取5个视野, 测量Bcl-2阳性表达细胞的平均光密度 (OD值) 。

1.3 统计学方法

应用SPSS20.0统计软件, 计量资料组间比较行t检验。

2 结果

2.1 AD和对照组全脑图

与对照组比较, AD小鼠完整脑组织表面泛白、无血色, 血管明显减少, 表明D-半乳糖联合三氯化铝已经对小鼠的脑组织形成退行性损伤。见图1。

图1 AD组和对照组小鼠全脑图

2.2 体重比较和糖水偏好实验结果

与对照组〔 (24.87±2.21) g〕比较, AD组小鼠的体重〔 (20.98±1.65) g〕明显下降 (P<0.05) ;与对照组〔 (94.38±8.39) η/%〕比较, AD组小鼠糖水偏好百分比〔 (56.67±4.46) η/%〕明显下降 (P<0.01) 。

2.3 免疫组化结果

与对照组相比, AD小鼠海马CA1、CA3和DG区Bcl2蛋白阳性表达明显减少, 呈深棕色阳性颗粒数目明显减少 (P<0.05, P<0.01) 。见图2, 表1。

图2 两组小鼠各区Bcl2表达免疫组化结果 (×400)

表1 两组小鼠海马各区Bcl2蛋白的表达比较 (n=15, ±s)

3 讨论

Luo等的实验结果表明, 利用D-半乳糖联合三氯化铝制备AD小鼠模型, AD组小鼠表现为学习记忆减退、皮质和海马区β淀粉样蛋白 (Aβ) 水平增高、Aβ代谢相关分子表达受影响, 可形成NFT、SP等典型的AD症状, 表明D-半乳糖联合三氯化铝诱导AD小鼠是一种稳定的、为国内外科研工作者所接受的AD动物模型。最新研究表明, D-半乳糖联合三氯化铝可造成小鼠海马区超氧化物歧化酶 (SOD) 等的活性下降, 导致学习记忆能力降低等AD症状的产生。神经细胞凋亡增加与神经退行性病变, 如AD等高度正相关, 细胞凋亡是导致学习、记忆退行性病变的机制之一。海马在认知、学习、记忆形成过程中起着重要作用。Bcl2在细胞线粒体外膜表面, 通过抑制线粒体释放凋亡诱导因子 (AIF) , 抑制内质网释放Ca等;同时, 通过调节线粒体内外膜的通透性抗细胞凋亡;此外, Bcl2还可抑制细胞超氧化合物的积累;Bax/Bax同源二聚体可以被Bcl2/Bax异源二聚体竞争性抑制, 从而达到抗细胞凋亡的目的。Bcl2可能通过维持细胞内钙稳态, 抑制促凋亡蛋白的释放, 抑制凋亡蛋白酶的活化及直接抗氧化等抗细胞凋亡。

免疫组化检测结果提示, D-半乳糖联合三氯化铝通过抑制抗细胞凋亡因子Bcl2的表达, 激活程序性的细胞凋亡信号通路, 导致海马神经细胞异常凋亡, 进而引起AD的发生、发展。

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作者简介：刘洋 (1979-) , 男, 博士, 讲师, 主要从事神经退行性疾病分子机制研究。

作者简介：陈瑶 (1982-) , 女, 硕士, 主治医师, 主要从事神经退行性疾病发病机制研究。